生物分离实验案例

实验一：牛乳中酪蛋白的提取

一、实验目的

1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。

二、实验原理

酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。

酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。

在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。

三、材料与试剂

市售牛奶

10mg/mL酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc－NaAc缓冲液

双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100mL，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500mL水中。两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH300mL，后用水稀释至1000mL，贮存于塑料瓶中。此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。

四、操作步骤

1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀

用量筒量取25mL牛乳两份分别置于50mL烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2MpH4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15min，弃上清液，收集沉淀。一份沉淀用于“除杂”步骤，另一份沉淀用0.1MNaOH溶液溶解并定容至100mL，用于“酪蛋白含量测定”步骤。

2、除杂

将上述沉淀捣碎，加入10mL95%乙醇，搅拌制成悬浮液。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10mL乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10mL乙醚洗涤沉淀两次，抽干。

将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m1）。

3、酪蛋白含量测定

（1）标准曲线的绘制

分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于干燥试管中，不足1.0mL者用0.1MNaOH

溶液补足1.0mL，然后分别加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度。以酪蛋白质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）酪蛋白含量测定

取?步骤1‖中样品溶液1.0mL，加入4.0mL双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波

长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。平行测定3次，求其平均值，并计算25mL牛乳中酪蛋白的质量（m2）。

五、结果与讨论

1、牛乳中酪蛋白含量的计算

含量（g/mL）=

2、酪蛋白提取得率的计算

得率（%）=

m2?100

牛乳体积（25mL）

m1

?100%

m2?100

六、思考题

1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？

4、比较牛乳中酪蛋白测定含量与理论含量大小，并对测定结果进行讨论。

实验二：大蒜细胞SOD酶的提取与分离

一、实验目的

1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤；

2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的`磷酸缓冲液体提取。由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。

邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

三、试剂和材料

新鲜蒜瓣，市售

磷酸缓冲液：0.05mol/L，pH7.8

氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿?无水乙醇=3?5（V/V）丙酮：用前冷却至4～10℃

0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）10mmol/LHCl

45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）

四、实验步骤

1、组织或细胞破碎

称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。2、SOD的提取

将上述破碎的组织或细胞，加入2～3倍体积（10-15mL）的0.05mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000r/min下，离心15min，收集上清液得提取液。

留出1mL备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。3、除杂蛋白

提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。

留出1mL备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。4、SOD的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。

将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5mL，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液。准确量取体积。

将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。5、SOD活力测定

参照李建武的《生物化学实验原理和方法》，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。

（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：

在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。

表1邻苯三酚自氧化测定加样表

试剂

0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）

蒸馏水10mmol/LHCl

45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）

总体积

加样量（mL）校零管——9.0

测定管4.54.4——0.19.0

（2）SOD酶活的测定：

在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。

表2SOD酶活测定加样表

试剂

0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）

蒸馏水10mmol/LHCl待测样

45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）

总体积

加样量（mL）校零管——9.0

测定管4.54.3——

（3）酶活力测定

酶活性单位定义为：在lml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个

活力单位。

按下式计算样品中SOD酶单位活力：

k0-k1样品液稀释倍数

?50%?反应液总体积?

加入样品液体积单位体积活力（U/ml）=k0

活性单位定义体积

总活力（U）=单位体积活力?样品液总体积

式中：反应液总体积=9mL；样品液稀释倍数=1；加入样品液体积=0.1mL；活性单位定义体积=1mLl；样品液总体积=实验中各样品实测体积。6、样品中可溶性蛋白含量的测定

从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液中分别取0.2mL、0.4mL、0.5mL，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍进行稀释，分别测定稀释液在260nm和280nm波长处的吸光值，按下式计算可溶性蛋白的含量：

蛋白质浓度(mg/mL)=(1.45A280?0.74A260)×稀释倍数

总蛋白（mg）=蛋白质浓度×样品液总体积

五、结果与讨论

将试验结果及相应的计算结果填入下表：

相关计算公式：

力力；回收率=粗酶液（或酶液）总活比活力U/mg=总活力（U）；纯化倍数=粗酶液（或酶液）比活

提取液总活力提取液比活力总蛋白（mg）

六、思考题

1、在SOD酶提取步骤中应注意的关键问题是什么？2、综合评价蛋白或酶的提取分离流程优劣的指标有哪些？

实验一：茶多酚标准曲线的测定

仪器：紫外分光光度计，比色皿，天平，容量瓶，移液管，pH计、试管

药品：没食子酸丙酯或茶多酚，酒石酸钾钠，硫(转载于:g没食子酸丙酯，蒸馏水溶液，移入25mL容量瓶并稀释至刻度，摇匀，配制成1mg/mL的标准溶液

A酒石酸亚铁溶液配制

准确称取0.1g硫酸亚铁，和0.5g酒石酸钾钠，混合，蒸馏水溶解后移入100mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀。

pH7.5磷酸盐缓冲液配制

磷酸氢二钠：准确称取分析纯磷酸氢二钠2.969g，蒸馏水稀释溶解，移入250mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，为a液

磷酸二氢钾：准确称取分析纯磷酸二氢钾，、2.2695g，蒸馏水溶解，移入250mL容量瓶，定容，B。

取A液体85mL，B液体15mL混合均匀，即成。

B标准曲线绘制

分别吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的没食子酸丙酯标准液于25mL容量瓶中，加入蒸馏水4mL，再加入酒石酸亚铁溶液5mL，用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，分光光度计在540nm处，1cm比色皿，分别测定吸光度。空白参比操作同上，不加没食子酸丙酯。以容量瓶中没食子酸丙酯的绝对含量mg为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，做线性回归。

C样品测定

取适量样品加入容量瓶，操作同上，没食子酸丙酯含量乘以换算系数1.5，求得茶多酚。

实验二超声法和回流法提取茶多酚的比较

实验仪器：

超声提取器、布氏漏斗、抽滤瓶、真空泵、烧瓶、量筒、分光光度计、比色皿、容量瓶等、实验试剂

茶叶、纯净水、茶多酚（没食子酸丙酯）、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等

操作方法

1、材料准备

称取一定量的茶叶，研钵粉碎。备用

2、提取

A、超声提取法

称取5g粉碎后茶叶末，放入烧瓶（塑料袋密封），加入100mL水，于超声提取器，50℃提取20min，抽滤，定容至100mL，待测。

B、回流提取法

称取10g粉碎后茶叶末，放入圆底烧瓶，加入100mL水，80℃提取40min，分别在1、3、5、7、10、15、20、30、40min取3mL样品，小漏斗过滤后，待测。测得茶多酚含量（mg/mL）以茶多酚含量为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。

3.含量测定

按照标准曲线的方法测定含量。

所需试剂及仪器

试剂：

没食子酸丙酯或者茶多酚，酒石酸钾钠，硫酸亚铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，

仪器：

紫外分光光度计，水浴锅，电子天平，pH计，超声提取器，量筒（100mL*1），容量瓶（25mL*8，100mL*4,250mL*2），比色皿*5，移液管（1.0mL*2,0.5mL*2,2mL*2,5mL*4）三角瓶250mL*2，小漏斗*2，试管架